Cyanine3.5 DBCO 的制備方法主要基于 Cyanine3.5 熒光染料與 DBCO 基團的共價結(jié)合，核心步驟包括磺化修飾、炔基引入及點擊化學反應，具體如下：

一、Cyanine3.5 的磺化修飾

• 目的：提高 Cyanine3.5 的水溶性，便于后續(xù)生物分子標記。

• 方法：通過磺化反應在 Cyanine3.5 分子中引入磺酸基團（如三磺酸修飾），形成磺化 Cyanine3.5（trisulfo-Cy3.5）。

• 產(chǎn)物特性：磺化后的 Cyanine3.5 具有良好的水溶性，發(fā)射波長為 604 nm，可用 561 nm 或 594 nm 激光激發(fā)，與 Texas Red® 濾光片兼容。

二、DBCO 基團的引入

• 目的：賦予 Cyanine3.5 生物正交反應能力，實現(xiàn)與疊氮化物的特異性結(jié)合。

• 方法：

• 直接合成：將 DBCO 基團通過化學鍵（如酰胺鍵、醚鍵）直接連接到磺化 Cyanine3.5 的分子骨架上。

• 聚乙二醇（PEG）橋接：通過 PEG 鏈將 DBCO 基團與磺化 Cyanine3.5 連接，形成 DBCO-PEG-Sulfo-Cy3.5。PEG 鏈可增加化合物的柔韌性和生物相容性，同時減少空間位阻。

• 產(chǎn)物特性：

• DBCO-trisulfo-Cy3.5：紫色固體，分子式為 C59H58N4NaO11S3，分子量為 1118.3。

• DBCO-PEG-Sulfo-Cy3.5：分子量可根據(jù) PEG 鏈長度調(diào)整（如 1k、2k、3.4k、5k、10k 等），純度 ≥95%。

三、點擊化學反應（SPAAC）的應用

• 目的：實現(xiàn) Cyanine3.5 DBCO 與疊氮化物的特異性結(jié)合，用于生物分子標記。

• 方法：

• 反應條件：在中性或微堿性條件下，DBCO 基團與疊氮化物發(fā)生無銅點擊化學反應（SPAAC），生成穩(wěn)定的三唑環(huán)產(chǎn)物。

• 反應優(yōu)勢：無需催化劑或額外能量輸入，反應條件溫和，生物相容性好。

四、制備過程中的關(guān)鍵控制點

• 磺化程度：需控制磺化反應條件，確保 Cyanine3.5 的磺化程度適中，以平衡水溶性和熒光性能。

• 反應純度：在 DBCO 基團引入和點擊化學反應過程中，需保持高純度，避免副產(chǎn)物干擾。

• 儲存條件：Cyanine3.5 DBCO 需在 -20°C 以下冰凍、干燥、避光保存，長期保存時建議充入惰性氣體（如氬氣或氮氣）保護。

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